PI單染的原理主要是根據細胞凋亡過程中細胞、亞細胞和分子水平發(fā)生的特征性變化。這些變化包括細胞核的變化、細胞器的變化、細胞膜成分的變化和細胞形態(tài)的變化，其中細胞核的變化很有特征。

PI簡介

熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可以對DNA進行染色的核染色試劑。它常用于細胞凋亡檢測。英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙錠類似物，嵌入雙鏈 DNA 后會發(fā)出紅色熒光。雖然 PI 不能穿過活細胞膜，但它可以穿過受損的細胞膜并對細胞核進行染色。 PI 通常與 Calcein-AM 或 FDA 等熒光探針一起使用，以同時對活細胞和死細胞進行染色。 PI-DNA復合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。

外觀：紅棕色粉末儲存條件：-20℃

PI單染法實驗原理

1、細胞核的變化：由于凋亡細胞細胞核的變化，導致各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA的染色性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對固定的凋亡細胞進行染色會降低 DNA 染色能力。許多學者將 DNA 染色性的降低視為凋亡細胞的標志之一。

2.光散射特性：凋亡細胞形態(tài)的變化影響其光散射特性。在流式細胞儀上，前向散射光與細胞的大小有關，而側向散射光反映了細胞內光的折射，與細胞內顆粒的數量有關。細胞凋亡時，細胞收縮，體積變小，因此前向散射光減少。這一特征通常被認為是凋亡細胞的特征之一。另外，由于細胞凋亡時染色體的降解和核破裂的形成，細胞內顆粒常增多，故凋亡細胞的側向散射光常增多。細胞壞死時，由于細胞腫脹，前向散射光增加；細胞壞死時側向散射光也增加，因此根據前向散射光和側向散射光可以區(qū)分凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據前向散射光和側向散射光判斷凋亡細胞的可靠性，很大程度上受檢測細胞形態(tài)的均勻性和核質比的影響。因此，在某些淋巴細胞凋亡中，通過光散射特性檢測細胞凋亡的可靠性較好，但在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性較差。基于光散射特性檢測凋亡細胞的主要優(yōu)點是，光散射特性可以與細胞的表面免疫熒光分析相結合，以區(qū)分經過這些特殊處理后發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。它還可用于活細胞的分類。

PI 單染試劑和儀器

1、PBS溶液；
2、PI染色液：將PI溶解于PBS(pH7.4)中，終濃度為100ug/ml。儲存在棕色瓶中，4°C 避光保存。
3,70%乙醇4,400目篩5，流式細胞儀

PI單染實驗步驟

1.收集細胞，500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)基。
2.用3ml PBS洗滌一次。
3. 離心除去PBS，加入冰冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小時。
4. 離心棄固定液，重懸于 3ml PBS 中 5 分鐘。
5. 過400目篩一次，500-1000 r/min離心5 min，棄PBS。
6. 用1ml PI染色液染色，4℃避光30min。
7、流式細胞儀檢測：PI被氬離子激發(fā)產生熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產生紅色熒光，分析熒光直方圖PI的強度，并分析前向散射光到側向散射光的散射。圖片。
8.結果判斷：在前向散射光與側向散射光的散點圖或地形圖上，與正常細胞相比，凋亡細胞的前向散射光較低，而側向散射光可高可低，這與正常細胞相比，凋亡細胞的前向散射光較低，而側向散射光可高可低。細胞類型；在分析PI熒光直方圖時，首先使用門技術排除雙或聚集的細胞以及發(fā)出微弱熒光的細胞碎片。在PI熒光直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期倍性峰之前出現(xiàn)一二二。例如，如果G1/G0期位置的熒光強度為1.0，則典型凋亡細胞樣品的亞二倍體峰的熒光強度為0.45，則可以使用雞和鮭魚紅細胞的PI熒光強度作為參考標準。 0.35 和 0.7，分別確保其間不是細胞碎片而是完整的細胞。

注：在細胞凋亡過程中，DNA 染色性的降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種 DNA 染色性的降低也可能是由于 DNA 含量的減少，或由于 DNA 結構的變化所致。這是由于其與染料結合的能力發(fā)生變化引起的。分析結果時應小心。